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现金彩票 脑脊液病原体分子诊断-新纪元降临
发布时间:2019-04-16 02:10 作者:现金彩票

  脑脊液(Cerebrospinal Fluid, CSF)是诊断中枢神经系统感染的重要标本,目前主要依赖常规生化、染色镜检、培养和血清学检测判断病原。然而这些方法有的灵敏度、特异度有限,易受抗菌药物影响,有的周期较长,临床仍有相当一部分感染的病原体(15~60% 脑膜炎和 40~70% 的脑炎)不能确定。

  近年来,分子检测技术突飞猛进,越来越多地应用到了病原体检测领域。它是指利用标本中的核酸作为检测对象,对病原体进行检测的方法。具有特异性、灵敏度高、快速等特点。以下总结了当前已使用的脑脊液病原体分子检测方法。

  PCR 是最常用的分子检测技术。原理即扩增病原体特有的核酸片段,检测以判断病原体的存在与否。包括普通 PCR、RT-PCR、实时定量 PCR(real-time PCR)、16s rRNA PCR、商业化 PCR 系统等。许多临床实验室开发了实验室自建 PCR 系统(laboratory-developed assay,LDA);市面上也有可售的试剂盒以保证更标准统一的检测。

  病脑的 PCR 检测事实上已替代培养成为诊断的金标准。HSV 脑炎的 PCR 灵敏度和特异度可达 96% 和 95%,CMV、VZV、JC 病毒以及 RNA 病毒如肠道病毒等的 PCR 检测也显示了较高的检验效能。其中 HSV 和 EV 的两款试剂盒已被美国 FDA 通过用于病脑的诊断。实时定量 PCR 能检测病毒的载量,在判断是潜伏感染病毒还是致病病毒的活化时优于普通 PCR。

  和培养相比,针对细菌的 PCR 检测灵敏度达 87%~100%,特异度达 98%~100%,对某些细菌(如奈瑟球菌)尤为灵敏。可在数小时内出结果;且不受抗生素使用的影响。16S rRNA PCR 也被运用到细菌性脑膜炎的检测中。16s rRNA 的基因存在于几乎所有细菌中,用针对该基因片段的引物行核酸扩增,可以确定大多数细菌 DNA 的存在与否。根据该核酸片段种间序列的差异,通过测序技术或种属特异的引物和探针,可以定位具体的细菌。

  相比普通 PCR 检测,16s rRNA PCR 同样有灵敏、特异、快速的特点,其诊断细菌性脑膜炎的灵敏度达 92%,特异度达 94%;更为重要的是,由于其采用通用引物,无需进行针对性的病原体检测,检测病原体范围更广,减少遗漏细菌的可能。

  缺点在于需要测序或其他后续检测,成本相对高;任何污染都可能引入杂菌而造成结果假阳性,因此标本无菌要求高;某些病原体由于种间序列的相似性,只能鉴定到属;测序有拷贝数的要求,数量不足可能失败;尚无标准化,各个实验室间因处理方法不同而检测效能不同。

  对于结脑的分子诊断,目前已有很多 LDA 和商业试剂盒试图达到快速诊断。总体来看,结脑 PCR 检测的灵敏度为 64%,特异度为 98%。有限的灵敏度、较高的成本和实验室基础和人员设置的要求都限制了结脑分子诊断的应用。

  一些自动分子检测平台的出现使得脑脊液病原体的诊断有快速、简便、自动化的趋势,且相比传统 PCR 检测,无需很严格的实验室配置,能保证更好的质量控制。

  FilmArray 脑膜炎/脑炎系统是一款基于多重巢式 PCR 的 CSF 病原体检测体系,由扩增机器和试剂条组成,试剂条控制反应体系,扩增仪控制反应条件。可对 200μLCSF 标本同时就 CNS 感染常见的 6 种细菌和 7 种病毒以及隐球菌进行排查。

  1. 灵敏、特异:目前较大样本研究提示,其与标准 PCR 方法和测序相比,一致性较好;

  2. 快速、便捷:手动操作 5 分钟,其余仪器全自动运行,能在 1 小时左右获得结果。

  3. 简单易读:操作和结果读取均十分简单,无须复杂培训。适合实验室条件一般的单位。

  但目前价格昂贵。预估 1 次检测的价格在 2000~3000RMB;且覆盖的病原体尽管已经包括了常见的各种病原体,但结核分枝杆菌、金葡菌、虫媒病毒等中枢感染常见病原体未被囊括;一台机器 1 小时只能同时处理 1 份样本,检测通量不高。

  Xpert MTB/RIF(Cepheid)是一款用于检测痰标本结核分枝杆菌和耐药性的自动化 PCR 平台,也被尝试用于 CSF 检测。但和以往结脑分子检测类似,已有的研究显示了 67%~70% 的灵敏度和超过 90% 的特异度。灵敏度的不足和较高的成本限制了其应用。

  LAMP 是核酸等温扩增技术的一种。该技术通过 2 对识别靶序列上 6 个特异区域的引物和一种具有链置换的 DNA 聚合酶,在恒温条件下扩增靶序列,比传统 PCR 具有更高的特异性和扩增效率且更迅速。有时增加一对环引物,使得扩增效率更高。已有用于细菌性脑膜炎检测的报道。

  2. 灵敏度高:小规模的研究显示,对流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟球菌、肺炎链球菌和结核分枝杆菌的检测灵敏度和特异度均优于传统 PCR;

  3. 无需特殊仪器,操作简单:相比传统 PCR 技术,LAMP 实现了恒温条件下的连续快速扩增,结果无需电泳或其他处理,用 DNA 结合染料(如 SYBR Green)处理后可肉眼观察反应物颜色变化,因此可在几乎任何实验室中进行,成本低,适合资源相对缺乏地区和床旁检测。

  但有如下缺点:LAMP 采用的环引物增加了扩增效率,但容易产生非特异性配对而导致假阳性结果;引物要求高,要筛选出合适的引物需要耗费大量的工作;肉眼识别有主观性,使用浊度计可改善结果判读;只能针对性检测单个病原体,无法进行广谱检测。目前用于 CSF 病原体检测的研究尚不多,有待更多应用来支持。

  即相对于第一代 DNA 测序技术而言的新型测序手段,能更快地测定高通量的基因数据。通过提取脑脊液中核酸、建立 DNA 扩增文库、测序,识别并排除人源性序列,可比对核酸来识别病原体的序列。该技术可行无靶向的病原体核酸广泛测定,无需针对性的引物设计,理论上可以实现「全病原体」的检测。目前主要用于疾病爆发时的病原体检测、基因特点和分子流行病学调查。

  有少量临床利用 NGS 成功检测患者 CSF 中病原体并治疗的例子。但目前因为其对实验室设备、人员、时间和结果解读均有较高要求;高宿主核酸背景往往限制了检测灵敏性;可用以结果分析的参考数据库还不健全;不能很好区分定植、感染和污染病原体,临床的推广还有很大的距离,可能有未来发展的潜力。

  总结中枢神经系统感染的病原学诊断一直是个难题,传统方法并不能较好满足临床的需要。PCR 的出现使得病原体快速诊断成为可能,随着技术的发展,多种多样的分子检测技术和平台不断提高诊断的效能、范围、便捷性和速度。但目前仍面临成本、设施和人员配备的要求高、对某些病原体灵敏度不足等问题,尚不能完全替代传统方法。有待更多的研究和对方法的改进和推广。

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